Сравнение методов определения общей бактериальной обсемененности молока

Одним из основных показателей качества молока сырья и выпускаемой продукции является показатель бактериальной обсемененности, характеризующий уровень гигиены производства, транспортировки и хранения продукции.

На сегодняшний день помимо классического арбитражного метода (стандартный метод подсчета бактерий на чашках Петри) ГОСТ 9225-84 «Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа» существуют различные методы оценки бактериальной обсемененности, которые отличаются условиями и временем проведения измерений.

В настоящее время на перерабатывающих предприятиях применяются методы, основанные на оценке метаболической активности, так и классические методы определения, к которым можно отнести следующие:

• метод определения редуктазы с метиленовым голубым метод основан на восстановлении метиленового голубого окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми в молоке микроорганизмами. По продолжительности обесцвечивания метиленового голубого оценивают бактериальную обсемененность сырого молока. Результаты данного метода можно использовать как косвенный качественный показатель бактериальной обсемененности молока-сырья. Аналогичный метод определения общей бактериальной обсемененности молока – метод определения редуктазы с резазурином, который тоже является качественным методом. Оценка результатов осуществляется по продолжительности изменения окраски резазурина.
• метод определения общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов основан на способности мезофильных аэробных и факультативно – анаэробных микроорганизмов размножаться на плотном питательном агаре при (30±1)ºС .
• метод определения общей бактериальной обсемененности по концентрации кислоты (лактат, пируват), аммиака и ионов аммония, по измерению бактериальной теплопродукции ГОСТ 27930-88 «Молоко и молочные продукты. Биокалориметрический метод определения общего количества бактерий». Метод основан на калориметрическом измерении тепловой мощности, выделяемой в процессе жизнедеятельности микрофлоры молока, которая является энергетической характеристикой ее физиологической активности.
• метод компании «Люмтек» ГОСТ Р 52415-2005 «Молоко натуральное коровье - сырье. Люминесцентный метод определения КМАФАнМ», основанный на определении бактериальной АТФ посредством люциферинлюциферазной реакции с люминометрической регистрацией возникающей люминесценции. Данный метод распространяется на сырое коровье молоко. Данная методика позволят измерять с наименьшим пределом обнаружения КМАФАнМ не менее 50 тыс. КОЕ/см3.
• метод измерения сопротивления (импеданса). Метод основан на измерении электрохимических свойств культуральной среды. Изменение импеданса происходит в питательной среде по мере того, как ее химический состав изменяется в результате роста и метаболической активности микроорганизмов. При этом незаряженные или слабозаряженные составляющие питательной среды превращаются в сильнозаряженные конечные продукты: белки метаболизируются до аминокислот, углеводы и жиры до органических кислот. Эти электрохимические изменения приводят к существенным изменениям импеданса, экспоненциальные изменения сигнала могут наблюдаться, когда количество микробных клеток достигает порога 106 – 107 клеток/мл. Среди разработанных и применяющихся в настоящее время исследовательских микробиологических систем, предназначенных для ускоренного обнаружения микроорганизмов на основе импедансных технологий, наибольшее распространение получил микробиологический анализатор "Бак Трак 4300" и «БиоТрак 4250» производства австрийской фирмы "SY-LAB".

Целью данного исследования было сравнение арбитражного классического и импедансного методов на примере определения общей бактериальной обсемененности молока сухого обезжиренного (рис.1). Измерения проводили на 14 образцах сухого обезжиренного молока одного производителя и 3 дат выработки.

Бактериологическое определение числа колониеобразующих единиц проводили согласно ГОСТ 9225-84 на питательной среде для определения КМАФАнМ производства «Биокомпас-С» (г.Углич). Определение КМАФАнМ импедансным методом проводили на приборе «БиоТрак 4250», согласно методическим указаниям МУК 4.2.1111-02, а также стандартам DIN10115 и DIN10120 (основные принципы обнаружения и количественного определения микроорганизмов импедансным методом).

Таблица 1.

Результаты определения общего микробного числа в сухом обезжиренном молоке классическим и импедансным методами.

По полученным результатам составили уравнение регрессии, его графическое изображение и определили коэффициент детерминации R2 (рис.1.).

Пропорциональность количества микроорганизмов в образце по отношению к времени определения изменения импеданса выражается математически с помощью линейной регрессии. Метрологические характеристики метода измерения определяются коэффициентом корреляции (r) и дисперсией (syx), выражаемой в логарифмических единицах. Чем ближе коэффициент корреляции к идеальному значению -1, тем более высокая корреляция между импедансным и классическим методом.

Время определения, ч

Рис.1 График регрессии импедансного метода определения КМАФАнМ в молоке сухом обезжиренном (где r=-0,9785; syx=0,3)

Результат полученной регрессии можно оценить как измерение (при пределе доверительной вероятности Р=0,95) 97% значений описываемых уравнением в зоне шириной ±0,3 логарифмических единицы.

Импедансный метод продемонстрировал достаточно высокое сходство с классическим методом по коэффициенту детерминации и метрологическим показателям.

К положительным характеристикам прибора БиоТрак 4250 относится возможность одновременного определения нескольких санитарно-значимых показателей (БГКП, дрожжи и плесени, сальмонеллы), за счет использования селективных питательных сред.

В дальнейшем планируется данный метод апробировать на большем количестве объектов исследований (молоко сырье, молоко пастеризованное, кисломолочные продукты и т.д.), провести измерения в соответствии с требованиями ИСО 16140-2003 «Микробиология пищевых продуктов и кормов животных. Протокол валидации альтернативных методов.» и стандартом ММФ 161 А «Молоко. Количественное определение бактериологического качества. Руководство по установлению и верификации уравнения пересчета результатов альтернативного и арбитражного методов» и метрологически аттестовать.